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Muita coisa mudou rapidamente com o teste do vírus SARS-CoV-2 (COVID-19). Várias opções comerciais estão agora disponíveis. Os laboratórios têm menos problemas para obter material de controle (amostras positivas não estão mais em falta). E os laboratórios que optaram por testar agora estão executando várias versões dos testes moleculares COVID-19 com uma combinação de plataformas de alta velocidade ou alto rendimento. Os testes rápidos de cartucho são usados ​​para remover pessoas do pronto-socorro / remover o isolamento de contato em pacientes internados, enquanto os ensaios de alto rendimento são usados ​​para triagem de rotina.

No entanto, ainda existem vários gargalos. Há escassez de kits de extração de ácido nucleico, swabs de coleta e meios de transporte viral. Felizmente, alguns estudos recentes demonstraram evidências preliminares do uso de tipos de amostra alternativos, métodos de coleta e condições de armazenamento.

Um dos primeiros princípios do diagnóstico molecular é o isolamento e a purificação do ácido nucleico. Portanto, foi surpreendente ver um relatório sobre um protocolo COVID-19 sem extração de Vermont (Bruce EA et al.). Este estudo analisou inicialmente duas amostras de pacientes e mostrou quedas na sensibilidade de ciclos de ~ 4Ct. Embora isso não seja adequado para a detecção em baixo nível, muitas amostras virais possuem altos níveis de vírus que ainda permitiriam a detecção. A equipe testou esse método em 150 amostras positivas da Universidade de Washington e encontrou 92% de sensibilidade com 35% de sensibilidade na faixa de baixa carga viral (valor Ct> 30). Isso foi aprimorado com uma breve etapa de inativação por calor (Tabela 1). Isso também foi observado em um estudo da Dinamarca, onde a breve inativação pelo calor de métodos sem extração (Direta) teve 97% de especificidade em 87 amostras (Tabela 2).

Tabela 1. Estudo em Vermont comparando a sensibilidade do RT-PCR direto (sem etapa de extração) com os resultados validados de 150 amostras provenientes da Universidade de Washington.
Tabela 2. O estudo da Dinamarca descobriu que os protocolos livres de extração (Direct) eram comparáveis ​​à detecção de RNA extraído (método de extração MagNA Pure) em 87 amostras.

Alguns estudos semelhantes no Chile também mostraram protocolos sem extração em um número maior de amostras e relataram uma perda de sensibilidade variando de 1 a 7 ciclos de Ct, dependendo dos primers utilizados.

Figura 1. P1 e P2 são os pacientes 1 e 2. NSS indica uma amostra de zaragatoa nasal onde o RNA foi extraído. RNA indica uma amostra sem extração de RNA.

Como este romance Coronavírus possui um genoma baseado em RNA, o RNA é alvo de testes moleculares. Como o RNA é suscetível à degradação, houve preocupações com o armazenamento de amostras. Deve ser refrigerado? Congeladas? Como vários ciclos de congelamento e descongelamento afetam a estabilidade das amostras? Existem alternativas viáveis ​​para o meio de transporte viral? Um estudo preliminar explorou essas questões muito bem. Eles pegaram X vários tipos de amostras (NP, BAL, mídia de armazenamento salino) e os armazenaram em 20C, 4C, -20 e -70 por vários dias até 1 semana e depois analisaram o nível de vírus detectado. Em cada caso, a perda de sensibilidade foi mínima (ciclos <2 Ct do dia 0 ao dia 7) à temperatura ambiente, com resultados comparáveis ​​em temperaturas mais baixas (Tabela 3).

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Tabela 3. Estabilidade do RNA SARS-CoV-2 detectado pelo Quest EUA rRT-PCR. VCM- meio de cultura viral; Meio de transporte da UTM-R Copan; Meio de microteste M4; LBA- lavagem broncoalveolar.

Por fim, tipos de amostra alternativos, como a saliva, ajudarão a romper o gargalo nos cotonetes e no meio de transporte viral. Fiquei surpreso ao saber que essa é uma alternativa adequada. Tendo trabalhado com a saliva para análise de DNA, sei que ela pode estar contaminada, de quantidade variável, inclui enzimas digestivas e é viscosa (viscosa). Essas não são características que um laboratório procuraria em um tipo de amostra sendo usado para testes de alto rendimento, onde várias falhas na amostra poderiam ocorrer. Mas esses pesquisadores de Yale mostraram níveis mensuráveis ​​de SARS-CoV-2 que facilitaram uma sensibilidade ainda maior do que os swabs nasofaríngeos (Wylie AL et al).

Figura 2. Os títulos de SARS-CoV-2 são mais altos na saliva do que os swabs nasofaríngeos de pacientes hospitalizados. (a) Todos os swabs nasofaríngeos positivos (n = 46) e amostras de saliva (n = 39) foram comparados pelo teste de Mann-Whitney (p <0,05). As barras representam a mediana e o IC95%. Nossos limites de detecção de teste para SARS-CoV-2 usando o teste US CDC "N1" estão no limite do ciclo 38, o que corresponde a 5.610 cópias de vírus / mL de amostra (mostradas como linha pontilhada e área cinza). (b) As amostras correspondentes aos pacientes (n = 38), representadas pelas linhas de conexão, foram comparadas pelo teste de Wilcoxon (p <0,05). (c) As amostras correspondentes ao paciente (n = 38) também são representadas em um gráfico de dispersão.

Com um aumento muito necessário nos testes para este país, é necessário implementar otimizações para melhorar a eficiência. Essas etapas, por si só, não serão suficientes, mas se pudermos coletar testes sem extração da saliva em casa, isso traria um benefício substancial para trazer testes fáceis para todos.

ATUALIZAÇÃO: Como isso foi escrito, o primeiro FDA EUA foi autorizado para um kit de coleta de saliva em casa para uso no laboratório de genômica clínica da Rutger (https://www.fda.gov/media/137773/download).

Referências

Observe: muitas dessas referências estavam em servidores de pré-impressão e não foram revisadas por pares.

  1. Bruce EA, Huang ML, Perchetti GA, et al. DETECÇÃO DIRETA DE RT-qPCR DO RNA DA SARS-CoV-2 A PARTIR DE HABITAÇÕES NASOFARNÍGENAS DO PACIENTE SEM UMA ETAPA DE EXTRAÇÃO DE RNA. 2020. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.20.001008v2.full#T2
  2. Wyllie AL, Fournier J, Casanovas-Massana A, Campbell M et al. A saliva é mais sensível à detecção de SARS-CoV-2 em pacientes com COVID-19 do que os swabs nasofaríngeos. medRxiv 2020. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.20067835v1#disqus_thread
  3. Fomsgaard AS, Rosentierne MW. Um fluxo de trabalho alternativo para a detecção molecular de SARS-CoV-2 – escape da falta de kit de extração de NA, Copenhague, Dinamarca, março de 2020. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.27.20044495v1.full. pdf
  4. Rogers AA, Baumann RE, Borillo GA, et al. Avaliação de meios de transporte e condições de transporte de amostras para a detecção de SARS-CoV-2 2 usando PCR de transcrição reversa em tempo real. JCM 2020.
  5. Beltran-Pavez C, Marquez CL, Munoz G et al. Detecção de SARS-CoV-2 a partir de amostras de swab nasofaríngeo sem extração de RNA. bioRxiv 2020. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.28.013508v1.full.pdf

-Jeff SoRelle, MD é residente-chefe de patologia no Centro Médico da Universidade do Texas em Dallas, TX. Seus interesses de pesquisa clínica incluem entender como o laboratório interage com a saúde transgênero e melhorar a interpretação de variantes genéticas.

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