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Olá de novo!

Espero que todos fiquem seguros e saudáveis ​​durante esses momentos infelizes. Meu último post foi sobre como ser um novo graduado em MLS e começar minha carreira como tecnólogo molecular no Transplant Lab da Northwestern University. O tempo voa definitivamente!

Introdução ao Short Tandem Repeat - Lablogatory 1Hoje vou fornecer uma introdução básica a um ensaio que recebi recentemente treinamento chamado Short Tandem Repeat (STR). Se você desse uma olhada no seu genoma, ele estaria repleto de muitas seqüências repetidas. Embora existam muitas classificações diferentes de sequências repetidas, os STRs são um tipo de sequência repetida em tandem em que cada repetição tem aproximadamente 2 a 7 nucleotídeos de comprimento.1,2,3 O STR é bem conhecido na ciência forense por ajudar a identificar um suspeito na cena do crime quando diferentes fontes de DNA estão presentes. No entanto, suas aplicações são muitas – desde confirmação de linha celular, teste paterno e até análise de quimerismo!4

Introdução ao Short Tandem Repeat - Lablogatory 2
Imagem 1. Eletroferograma representando dois alelos diferentes (11 e 17) em um locus (D6S1043). O alelo 11 tem 11 repetições e o alelo 17 tem 17 repetições.

Os STRs são polimórficos, uma característica útil entre muitos, o que torna sua utilização na identificação da fonte de DNA particularmente vantajosa. Um alelo STR é definido pelo número de vezes que a sequência de repetição, definida acima, se repete. (Imagem 1).1 Os indivíduos são heterozigotos ou homozigotos em cada locus. À medida que o número de loci STR sendo avaliado aumenta, o poder estatístico da discriminação aumenta e a probabilidade de outro indivíduo ter o mesmo perfil se torna cada vez mais improvável e a detecção de pequenas diferenças aumenta.3,4 Em nosso laboratório, avaliamos um total de 21 locais diferentes!

Além disso, em nosso laboratório de HLA, utilizamos o STR para monitorar o status do quimerismo em pacientes submetidos a um transplante alogênico de células-tronco. Antes do transplante, os pacientes são correspondidos a um doador pelo sistema HLA (diferente do STR). Uma vez confirmada a correspondência do HLA, utilizamos o pré-transplante do paciente e a amostra do doador para gerar alelos informativos STR. Alelos informativos são alelos presentes apenas no receptor e não no doador. Esses alelos são importantes porque os transplantes de células-tronco substituem a medula do receptor e a detecção do DNA do receptor em amostras pós-transplante é crucial para identificar a rejeição ou recaída de sua doença. Além disso, os loci que contêm alelos informativos são definidos como loci informativos; esses são os loci usados ​​para identificar a porcentagem de quimerismo (Imagem 2).

Introdução ao Short Tandem Repeat - Lablogatory 3
Figura 2. Doador e receptor (pré-transplante) estão representados nos dois primeiros eletroferogramas. As tags “D1R” verdes representam alelos compartilhados, as tags “D1” azuis representam alelos específicos de doadores e as tags “R” marrons representam alelos específicos de destinatários. No primeiro locus, AMEL, não existem alelos informativos e, portanto, não é um locus informativo. No próximo lócus, D3S1358, há um alelo compartilhado, 15, um alelo doador, 17 e um alelo informativo do destinatário, 18. Os locus informativos possuem alelos informativos do destinatário e podem detectar a presença de DNA do destinatário em uma amostra – neste caso todos os seguintes locais após o AMEL são locais informativos. O CD3 (pós-transplante) é representado no terceiro eletroferograma. Neste exemplo, é claro que o paciente está tendo algum tipo de falha do enxerto ou recorrência de sua doença porque suas próprias células, em vez de apenas o doador, estão presentes.

Quando as células receptoras começam a ressurgir, podemos detectar os picos relativos dos alelos e atribuí-los ao receptor ou doador, consultando os alelos informativos. Os picos de alelos são então utilizados por meio de equações em nosso software que medem a área sob esses picos definidos e depois calculam um quimerismo percentual de doadores. Depois que esse relatório informativo é criado, podemos comparar qualquer amostra pós-transplante para determinar o status de quimismo do paciente (Imagem 2).

Interessante o suficiente, não isolamos o DNA do buffy pós-amostra como faríamos com outras amostras. Em vez disso, separamos cada pós-amostra em um total de três subamostras. O primeiro é simplesmente o sangue periférico do paciente – nada sofisticado. Os outros dois são isolados do resto do sangue periférico que não foi usado em duas linhagens celulares separadas – linfócitos (CD3 +) e mielócitos (CD33 +). Esse processo é extremamente trabalhoso, podendo processar um conjunto de até 8 a 12 pacientes por vez e cada conjunto leva de 4 a 5 horas.

O processo começa aliquotando o sangue periférico para o isolamento do DNA (amostra 1) e pegando o restante e colocando-o sobre um meio de separação de linfócitos (LSM). Em seguida, a colheita da camada de linfócitos / células brancas do LSM desmembrado. Em seguida, adicionamos coquetéis de seleção de anticorpos CD3 e CD33 e contas magnéticas. Em seguida, fazemos uma série de lavagens com ímãs e, eventualmente, terminamos com nossas populações de células CD3 e CD33 purificadas. Sua pureza é determinada por citometria de fluxo, um componente importante para confirmar que nossos subconjuntos de leucócitos não estão contaminados com outras populações de leucócitos – pois a contaminação derrotaria o objetivo de analisar diferentes linhagens.

Finalmente, pegamos o DNA isolado das três subamostras e o amplificamos com iniciadores específicos e marcadores fluorescentes por meio de PCR. Em seguida, as amostras são carregadas em um instrumento de eletroforese capilar. Este instrumento detectará cada comprimento de fragmento, definido pelos iniciadores e pelas repetições internas, e poderá identificar esses fragmentos através de tamanho, etiquetas fluorescentes, lasers e detectores. O instrumento irá gerar dados que podemos levar para nossa plataforma de análise, que é o ChimerMarker. Com isso, podemos analisar os dados e gerar nossos relatórios clínicos.

Embora extremamente demorado, o quimerismo específico da linhagem é crítico no transplante de células-tronco, porque é mais informativo e sensível do que a análise total de leucócitos – sendo várias magnitudes mais sensíveis do que analisar apenas o sangue periférico. Permite a detecção precoce de pequenas populações de células quiméricas que, de outra forma, podem não ser detectadas, pois um subconjunto no sangue periférico pode “mascarar” outro subconjunto que possui um percentual crescente de células receptoras. O diagnóstico dessas populações de células quiméricas de pequenas células o mais cedo possível é crítico para intervenções terapêuticas e reduções nas rejeições de enxertos.2,5,6

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Além disso, não apenas a detecção é importante, mas, por meio de nossa análise, podemos calcular a porcentagem de células doadoras e receptoras. Muitas vezes, relatamos a quimioterapia da porcentagem de doadores (%). Por exemplo, um paciente aos 322 dias após o transplante pode ter um quimerismo de doador de 96% no sangue periférico, 100% na linhagem CD33 e 73% na linhagem CD3. Então, no dia 364 após o transplante, eles podem estar em 100% no sangue periférico, 100% na linhagem CD33 e 92% na linhagem CD3. Duas coisas a serem observadas neste exemplo é que as porcentagens estão mudando (aumentando o quimerismo dos doadores nesse caso) e que o sangue periférico expressou 100% quimerismo na segunda amostra aos 364 dias, mas quando analisamos especificamente a subpopulação CD3 aos 364 dias, ainda havia 8% das células receptoras presentes (Imagem 3 e 4).

Introdução ao Short Tandem Repeat - Lablogatory 4
Figura 3. Amostras aos 322 dias após o transplante. O sangue periférico relata 96% de quimerismo de doadores. CD3 e CD33, purificados a partir de sangue periférico, relatam 73% e 100% de quimerismo de doadores, respectivamente.
Introdução ao Short Tandem Repeat - Lablogatory 5
Figura 4. Amostras aos 364 dias após o transplante, mesmo paciente da Figura 3 acima. O sangue periférico relata 100% de quimerismo de doadores. CD3 e CD33, purificados a partir de sangue periférico, relatam quimeros de 92% e 100% dos doadores, respectivamente.

Alguns estudos concentraram-se não apenas nas tendências das mudanças percentuais, mas também em sua constelação percentual relativa. Por exemplo, um estudo descobriu que o aumento das células CD3 receptoras tinha um fator preditivo aumentado de rejeição do enxerto. Verificou-se também que outras populações de subleucócitos aumentaram esse poder preditivo.5 Ainda mais, alguns estudos analisaram o quimerismo e sua utilidade na previsão da doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD). Esta doença é definida por leucócitos doadores atacando os leucócitos e tecidos do receptor. Através dessas e de outras descobertas, o potencial e a aplicabilidade do monitoramento do quimerismo são extremamente cruciais para o atendimento ao paciente durante a progressão do transplante.2,5,6,7

Embora o enxerto seja um processo muito dinâmico, variando de indivíduos e tipos de doenças, o monitoramento do enxerto é uma maneira de monitorar e, finalmente, influenciar as abordagens terapêuticas.2,5,6 Tenho orgulho de poder contribuir para a equipe maravilhosa da Northwestern University e me esforço para aprender mais sobre o processo – clínico e no laboratório. Em artigos futuros, espero entrar em mais detalhes sobre o processo e outros ensaios que realizamos.

Obrigado pela leitura! Até a próxima vez! Fique bem e seguro durante estes tempos de incerteza!

Referências

  1. Tecnologias da vida. 2014. Análise de fragmentos de DNA por eletroforese capilar. Thermo Fisher Scientific. http://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf.
  2. Kristt, D., Stein, J., Yaniv, I., & Klein, T. (2007). Avaliação quimérica quantitativa longitudinalmente: considerações técnicas, aplicações clínicas e viabilidade de rotina. Transplante de Medula Óssea, 39 (5), 255–268. doi: 10.1038 / sj.bmt.1705576
  3. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de um programa de controle de qualidade de alimentos na indústria alimentícia. Molloy, K., Folarin, N., Whitby, L., Snowden, JA, Reilly, JT e Barnett, D. (2015), Monitoramento do quimerismo após transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (TCTH): Recomendações técnicas para o uso de técnicas baseadas em Short Tandem Repeat (STR), em nome do Serviço Nacional de Avaliação da Qualidade Externa do Reino Unido para Leucócitos Grupo de Trabalho sobre Imunofenotipagem Quimerismo. Br J. Haematol, 168: 26-37. doi: 10.1111 / bjh.13073
  4. Análise de repetição curta em tandem no laboratório de pesquisa. (2012). Recuperado em 10 de abril de 2020, em https://www.promega.com/resources/pubhub/short-tandem-repeat-analysis-in-the-research-laboratory/
  5. Breuer, S., Preuner, S., Fritsch, G., Daxberger, H., Koenig, M., Poetschger, U.,… Matthes-Martin, S. (2011). Teste precoce de quimioterapia para receptores nas linhagens de células T e NK para avaliação de risco de rejeição de enxertos em pacientes pediátricos submetidos a transplante alogênico de células-tronco. Leucemia, 26(3), 509-519. doi: 10.1038 / leu.2011.244
  6. Buckingham, L. (2012). Diagnóstico molecular: fundamentos, métodos e aplicações clínicas. Filadélfia: F.A. Davis Company.
  7. Rupa-Matysek, J., Lewandowski, K., Nowak, W., Sawiński, K., Gil, L., e Komarnicki, M. (2011). Correlação entre a cinética do quimerismo CD3 e a incidência de doença do enxerto versus hospedeiro em pacientes submetidos a transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas. Procedimentos de transplante, 43(5), 1915-1923. doi: 10.1016 / j.transproceed.2011.02.011
Introdução ao Short Tandem Repeat - Lablogatory 6

-Ben Dahlstrom se formou recentemente no programa NorthShore University HealthSystem MLS. Atualmente, ele trabalha como tecnólogo molecular da Northwestern University em seu laboratório de transplantes, realizando a tipagem de HLA em transplantes de medula óssea e órgãos sólidos. Seus interesses incluem microbiologia, molecular, imunologia e banco de sangue.

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