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Desde a última vez que escrevi sobre algumas opções de teste disponíveis para o COVID-19, há apenas 1 mês, muitas coisas mudaram nos requisitos regulamentares e nas empresas que oferecem opções de teste. Com isso em mente, além do fato de que as coisas provavelmente continuarão mudando, escreverei para abordar os desafios atuais e futuros dos testes de laboratório do COVID-19.

  1. Que material de controle pode ser usado?
  2. Como posso tornar as amostras seguras?
  3. Questões e soluções da cadeia de suprimentos.
  4. Resultados falso-negativos dos testes COVID-19: o que dizer aos médicos.
  5. Testes sorológicos: testes e desafios futuros

Material de controle

Como o FDA disse que amostras inventadas poderiam ser usadas, isso significa que o RNA pode ser cravado em uma matriz clínica para extração. Embora isso tenha começado com a exigência de RNA genômico, foi afrouxado para incluir o DNA do plasmídeo. No entanto, eu recomendaria não usar o DNA plasmídico, porque, quando amplificado, pode facilmente causar contaminação e, diferentemente do RNA, o DNA pode persistir no ambiente por um longo tempo. Certa vez, ouvi uma história sobre um diretor de laboratório que achava muito cuidadoso, mas com a pipetagem eles contaminaram o laboratório em três dias e tinha que ser limpo por 4 semanas.

Tivemos alguns problemas ao usar RNA transcrito in vitro (apenas do gene N) e RNA genômico, porque a recuperação foi muito baixa. Descobrimos que partículas virais intactas eram melhores em experimentos de otimização usando cepas endêmicas de controle de SARS (controles Zeptometrix, Tabela 1). Os valores de RNA Ct livre caíram acentuadamente (mais de 1000 vezes) quando adicionados à matriz nasofaríngea (NP) ou ao meio de transporte viral (VTM). No entanto, níveis muito mais baixos do controle viral encapsulado tinham níveis consistentes de amplificação.

Dicas para testes COVID-19 - Lablogatory 1

Tabela 1. Amplificação de RNA viral livre vs. partículas virais quando adicionado à matriz

Portanto, usamos uma amostra de RNA de SARS-CoV-2 sinteticamente encapsulada chamada Accuplex (SeraCare, Figura 1), que proporcionou boa recuperação e um limite de detecção de até 260 cópias / mL (5 cópias / reação). Material similar alternativo que não avaliamos inclui: RNA COVID-19 sintetizado dentro de E. coli inativada (Zeptometrix) e RNA blindado (Asuragen).

Dicas para testes COVID-19 - Lablogatory 2
Figura 1. Esquema de como ocorre uma partícula viral criada sinteticamente

Segurança de amostras de laboratório

Uma recomendação de segurança do FDA era realizar a extração de amostras em um Capuz de nível 2 de biossegurança. No entanto, a extração de alto rendimento não pode ser feita facilmente dessa maneira. Para nós, tivemos que preparar amostras no exaustor e levá-las ao extrator de sistema fechado independente. Nosso micro colega teve a ideia criativa de fazer “Lise fora da placa ”, qual seria inativar o vírus no bairro antes de caminhar. Mais tarde, descobrimos que combinar a lise com a matriz NP antes de atingir o RNA estabilizou o RNA para uma medição precisa. Conseguimos encontrar um LOD de 14 cópias / reação dessa maneira.

Alguns laboratórios propuseram o uso inativação por calor (~ 30 minutos a 50-60 ° C) de vírus como medida de segurança, mas atualmente não há literatura publicada sobre como isso afeta a sensibilidade.

Questões da cadeia de suprimentos

Você certamente já ouviu falar de todas as novas empresas que lançaram novas plataformas de teste e ensaios para o teste COVID-19 até agora. No entanto, a desvantagem é que, a menos que você já tenha o instrumento deles, provavelmente não poderá obter reagentes a tempo de realizar o teste. Mesmo se você tiver um instrumento, recursos limitados exigem alocação com base em áreas de alto risco, é provável que você receba menos kits do que gostaria. Além disso, os laboratórios de referência ainda estão aumentando a capacidade e estão retornando resultados com tempos de resposta longos atualmente (~ 1 semana). Isso apóia a estratégia de traga o teste internamente, para que você possa obter resultados rapidamente e ter controle sobre pelo menos o suprimento de reagentes de seu laboratório. Se você possui a instrumentação de outro EUA aprovado pela FDA, pode começar a realizar testes se seguir exatamente esse protocolo – o CDC é o mais amplamente usado.

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Testes de falsos negativos de COVID-19

É difícil avaliar quando apenas uma modalidade de teste de laboratório (PCR) está disponível, mas os médicos relatam resultados negativos em um paciente com sintomas clássicos e um histórico de contato com uma pessoa COVID-19 +. Dada a impressionante sensibilidade analítica do teste (geralmente 1 cópia do RNA em 1 ml de amostra), a provável explicação é que há um problema com a amostra. A amostragem adequada de NP requer a colagem do swab na parte traseira da cavidade nasal. Além disso, esse vírus pode residir mais na via respiratória inferior (pulmões) e simplesmente não estar presente na área amostrada. É por isso que a amostragem repetida pode ser útil. No entanto, o resultado deve ser o mesmo, se você tiver ou não um teste negativo: se você tiver sintomas, deve se auto-isolar, a menos que precise de cuidados emergentes devido à falta de ar ou outros sintomas que não podem ser gerenciados em casa. o laboratório está familiarizado com essas limitações pré-analíticas isso pode surgir, mas é útil explicar isso aos médicos.

Testes sorológicos: testes e desafios futuros

A sorologia pode ser muito útil como um método separado do qPCR para determinar se alguém foi infectado com SARS-CoV-2. Observe que isso está no passado. Um pequeno (n = 9) estudo de pré-impressão da Nature indica que a conversão sorológica começa por volta dos 8 ou 10 dias após o início dos sintomas, o que geralmente não ocorre em um período clinicamente útil. No entanto, esses testes são mais baratos e fáceis de realizar, portanto podem ser úteis para fins epidemiológicos para determinar quem foi infectado pelo COVID-19. Dados genéticos iniciais indicam que a taxa de mutação é lenta (Taxa de mutação 4x mais lenta em comparação com a gripe sazonal), como seria de suspeitar de vírus baseados em RNA, portanto, o vírus não deve mudar o suficiente para causar reinfecção em alguém com níveis suficientes de anticorpos.

Dicas para testes COVID-19 - Lablogatory 3
Figura 2. Esquema do primeiro teste de anticorpos COVID-19 para receber autorização de uso de emergência da FDA.

No entanto, vários desafios na interpretação desses testes de anticorpos incluem:

  1. Alguns dados conflitantes sobre a rapidez com que a IgM se desenvolve em relação ao aparecimento dos sintomas
  2. O que é cronograma para produção de IgG?
  3. Descartando reatividade cruzada com outras estirpes de coronavírus que causam infecções respiratórias superiores.

Referências

  1. Wolfel R, Corman VM, Guggemos W et al. Avaliação virológica de pacientes hospitalizados com COVID-2019. Epub da natureza antes da impressão. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x_reference.pdf
  2. Mitchell S, George K et al. Procedimento de verificação para testes comerciais com Autorização de Uso de Emergência para a detecção de RNA SARS-CoV-2. Sociedade Americana de Microbiologia
  3. https://www.livescience.com/coronavirus-mutation-rate.html
Dicas para testes COVID-19 - Lablogatory 4

-Jeff SoRelle, MD é residente-chefe de patologia no Centro Médico da Universidade do Texas, em Dallas, TX. Seus interesses de pesquisa clínica incluem entender como o laboratório se cruza com a saúde transgênero e melhorar a interpretação de variantes genéticas.

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