cupom com desconto - o melhor site de cupom de desconto cupomcomdesconto.com.br

[ad_1]

O FDA está agora democratizando os testes do novo coronavírus: SARS-CoV-2 (o vírus que causa a síndrome da doença COVID-19 – a partir de agora vou chamá-lo COVID-19, pois esse é o nome coloquial que a maioria das pessoas conhece), permitindo laboratórios de teste de alta complexidade nos Estados Unidos. Essa mudança permitirá que mais laboratórios testem o COVID-19. Uma postagem anterior da colaboradora Constantine Kanakis descreve a biologia do vírus, por isso não repetirei esse material. Em vez disso, vou me concentrar em algumas considerações na validação de um teste molecular COVID-19 de Teste Desenvolvido em Laboratório (LDT).

A presidente da AACC, Carmen Wiley, disse que existem 11.000 laboratórios de testes de alta complexidade nos EUA, que podem se qualificar para a realização desses testes. No entanto, nem todos esses laboratórios têm experiência em molecular e virologia; portanto, outros colocaram o número de laboratórios com equipe e instrumentação qualificados em 400.

Ensaios e metas publicados: Como uma visão geral, a figura abaixo (Figura 1) resume alguns ensaios publicados do COVID-19. Como você pode ver, a principal estratégia envolve o uso da estratégia da sonda TaqMan, em que uma sonda curta é degradada pela polimerase Taq, liberando uma molécula fluorescente (bola verde) de uma molécula extintora (bola azul). A abordagem TaqMan permite o desempenho rápido do teste e a fácil interpretação. Um laboratório do Japão está usando amplificação por PCR aninhada e sequenciamento dos genes Orf1a e S também.

Como validar um ensaio COVID-19 - Lablogatory 1
Figura 1. A estrutura genética do COVID-19 é abreviada acima com os diferentes genes direcionados exibidos. Os nomes das instituições que publicaram seu procedimento de ensaio junto com os reagentes TaqMan que foram usados ​​segundo os ensaios são mostrados acima. Os primers são representados por pequenas setas com uma sonda TaqMan no meio, representada por uma linha preta com círculos verdes e azuis indicativos da molécula fluorescente e de seu inibidor. O conjunto duplo de setas para o ensaio japonês representa uma estratégia de PCR aninhada.

Em sílico Reatividade cruzada:

As orientações da FDA permitem que a reatividade cruzada seja minimamente avaliada em sílico demonstrando “homologia superior a 80% entre o iniciador / sondas e qualquer sequência presente no microrganismo alvo. ” Os locais dos primers podem ser encontrados na publicação de cada protocolo (exceto Thermo) e podem ser confirmados verificando o site NCBI Blast e eles realmente têm uma seleção de beta-cornavírus (Figura 2) agora que permite pesquisar a reatividade do seu primer através de outros vírus relacionados – Muito útil!

Como validar um ensaio COVID-19 - Lablogatory 2
Figura 2. Selecione Betacornavirus antes de inserir sua sequência do iniciador / sonda para confirmar a reatividade cruzada.

Projeto do Primer / Probe:

A região N é o site mais popular para sondagem e é incluída na maioria dos kits uma vez e no kit CDC três vezes. Foi o reagente definido para N3 no kit do CDC que estava com dificuldades; portanto, você pode optar por não incluir esse componente no seu LDT. Se você deseja ver como os diferentes conjuntos de iniciadores disponíveis se alinham à sequência do gene N, você pode ver abaixo os iniciadores marcados com base em sua fonte. Muitos se sobrepõem, talvez porque muitas pessoas pensassem que o mesmo site era um bom alvo (Figura 3).

Como validar um ensaio COVID-19 - Lablogatory 3
Figura 3. Gene N de COVID-19 juntamente com iniciadores marcados de alguns ensaios publicados. As informações na fonte da sequência são mostradas no canto inferior direito com o link.

Ensaios disponíveis comercialmente:

cupom com desconto - o melhor site de cupom de desconto cupomcomdesconto.com.br

Uma parte importante da validação do seu teste COVID-19 é fazer isso rapidamente. portanto kits comercialmente disponíveis seria útil, no entanto, existem apenas duas fontes disponíveis comercialmente no momento: IDT e Thermo. A IDT está produzindo um kit com o design do CDC. A Thermo produziu seu kit nos últimos meses e não possui nenhuma informação de validação publicada que eu possa encontrar. Além disso, o Thermo, quando verifiquei agora o número de catálogo, diz que este produto não está disponível … não sei o que isso significa, mas talvez você possa tentar entrar em contato com eles. Lista IDT e Thermo reagentes plasmídeos de controle para seus ensaios.

Controles para o ensaio:

A redação do anúncio da FDA era interessante, pois 1) não requeria amostras clínicas, mas permite “amostras clínicas inventadas. ” “Amostras reativas inventadas podem ser criadas ao inserir RNA ou vírus inativado em sobras de amostras clínicas. ” Uma grande dificuldade é o acesso ao RNA COVID-19 real ou vírus inativado. Percebi que as orientações não diziam que o ensaio DEVE usar RNA. Assim, a maioria dos laboratórios teria acesso ao DNA do plasmídeo, que poderia ser potencialmente usado.

Dada a disponibilidade limitada de RNA para uso de validação, um laboratório pode considerar executar grande parte da otimização do ensaio com o DNA do plasmídeo COVID-19 enquanto aguarda o acesso ao RNA. Gostaria de ter certeza de que meu teste poderia extrair, amplificar e detectar RNA como parte da validação clínica.

Asuragen pode produzir RNA blindado, com RNA sintético empacotado dentro de um capsídeo viral, o que seria um controle útil para extração, amplificação e detecção. No entanto, ouvimos isso não estará disponível por mais um mês.

Tom Stenzel (diretor do Escritório de Diagnóstico In Vitro e Saúde Radiológica do Centro de Dispositivos e Saúde Radiológica da FDA (CDRH)) disse A FDA, a BARDA e o CDC priorizarão e coordenarão as remessas de materiais virais para os laboratórios quando estiverem prontos para validar os testes. de acordo com um webinar com laboratórios na segunda-feira. Atualmente, o FDA está direcionando consultas à BEI, que supostamente prioriza solicitações para enviar amostras em 12 a 72 horas.

Por fim, pode-se tentar usar em vitro RNA sintetizado seqüências em torno de seus alvos de primer como controle por enquanto e pode ter melhor sorte em obter o produto em breve. Esse é o controle que está sendo enviado com os kits do CDC para os laboratórios públicos.

Limite de detecção é desconhecido o que provavelmente é clinicamente relevante, pois não sabemos como são os níveis em pessoas com doença precoce versus tardia versus grave versus doença leve. O FDA apenas diz que você deve conseguir detectar 95% das amostras (19 de 20) que são x1-x2 o limite de detecção.

Notificação da FDA:

Este é o passo final e importante. Depois de ir ao ar, você deve notifique o FDA com um formulário de ensaio de uso de emergência (EUA) dentro de 15 dias. Analisando o formulário, não parece haver explicações complexas ou requisitos atrasados ​​para relatórios, que não seriam encontrados em um documento de validação de laboratório padrão.

Considerações finais / Futuras soluções comerciais:

Essas informações são as melhores do que sei agora, com base nas informações atuais – este não é um guia completo e a orientação da FDA deve ser lida com atenção para todos os detalhes de conformidade. As informações estão mudando rapidamente e provavelmente mudarão mais se o número de casos de COVID-19 nos Estados Unidos aumentar. Cepheid, Luminex e BioFire estão trabalhando em ensaios que serão lançados em vários meses e seriam fáceis de usar em muitos laboratórios que já possuem um ou ambos os sistemas – no entanto, pode ser necessária uma validação completa para um LDT, mas eu não tenho certeza, pois é necessário um esclarecimento sobre os EUA. Embora existam várias soluções comerciais disponíveis, não sabemos como a demanda pode afetar a oferta de cada empresa. Felizmente, alguns grandes laboratórios de referência como LabCorp e Quest estão buscando desenvolver um teste COVID19. Boa sorte, fique seguro e sinta-se livre para entre em contato comigo com todas as perguntas nos comentários abaixo para que todos possam se beneficiar da discussão!

Referências

Em vez de uma lista de referências, incluí links da Web para as fontes de informações mais atuais e diretas.

Como validar um ensaio COVID-19 - Lablogatory 4

-Jeff SoRelle, MD é residente-chefe de patologia no Centro Médico da Universidade do Texas em Dallas, TX. Seus interesses de pesquisa clínica incluem entender como o laboratório se cruza com a saúde transgênero e melhorar a interpretação de variantes genéticas.

[ad_2]

Deixe uma resposta

O seu endereço de e-mail não será publicado. Campos obrigatórios são marcados com *